Bij DFNA22 mist één van Onno's twee MYO6-kopieën een stukje door de variant c.2416+5G>A. Voor de therapie hangt alles op één vraag: produceert dat allel niets (dan geef je gewoon een werkende kopie bij), of een kapot, mogelijk giftig eiwit (dan moet je de bron corrigeren)? Het antwoord zit in één regel van de cel — de 50-nt-regel — en in één experiment dat 'm zou bewijzen. Deze pagina maakt beide zichtbaar.
Waarom deze ene ja/nee-vraag de hele therapie-keuze bepaalt.
Een dominante ziekte met een dosage-verlies kan op twee manieren ontstaan. Welke het is, bepaalt wat een therapie moet doen:
| Mechanisme | Wat het mutante allel doet | Wat de therapie moet doen |
|---|---|---|
| Haploïnsufficiëntie | Maakt niets — het foute mRNA wordt opgeruimd vóór er eiwit van komt. Je houdt ~50% myosine VI over. | Route 1 · gene augmentation — een werkende MYO6-kopie bijgeven volstaat. De simpelste route. |
| Dominant-negatief | Maakt een getrunceerd eiwit dat de goede kopie actief saboteert (bv. verkeerde dimeren, actine-sequestratie). | Route 2 · base editing — de foute base terugdraaien aan de bron. Bijgeven helpt dan niet genoeg. |
Vijf in-silico modellen (SpliceAI, Pangolin, SAI-10k, Carbon-3B, AlphaGenome) zijn het eens: exon 23 wordt overgeslagen. Wat er dán gebeurt, is pure telkunde.
GTAGG → GTAGANonsense-mediated decay ruimt een mRNA op als het stopcodon te vroeg komt. "Te vroeg" heeft een precieze definitie — en die kun je narekenen.
Kies een allel — de tekening, de meting en het NMD-oordeel bewegen mee:
De marge is niet krap maar extreem: het premature stopcodon zit 1239 nt en 11 juncties vóór de grens. Geen enkele redelijke transcript-variatie draait dat om. En de gezonde controle valt correct aan de ontsnap-kant (+198 nt, in het laatste exon) — dat bewijst dat de methode klopt: alleen het mutante transcript triggert de regel.
Een eerlijke gate laat de open randen zien. Dit is een voorspelling van een regel, geen meting.
Een +5-donorvariant verzwakt de splice-site, maar zelden 100%. Splicet een deel tóch normaal, dan kan er een klein, NMD-ontsnappend getrunceerd eiwit ontstaan. NMD van het schone skip-product sluit een dominant-negatief nevencomponent niet volledig uit.
MYO6 is LoF-tolerant (pLI 0,09, LOEUF 0,50): schone haploïnsufficiëntie hóórt geen dominante ziekte te geven. Deze berekening verklaart die spanning niet — reden om dominant-negatief niet voortijdig af te schrijven.
Dit is de canonieke NMD-regel toegepast op de opgehaalde sequentie — geen wet-lab-meting. Vijf modellen zijn het eens over de skip, maar in-silico ≠ compleet.
Base editing corrigeert de variant aan de bron en is dus mechanisme-agnostisch — de enige route die niet op deze gate hangt. Zolang de skip-fractie niet gemeten is, blijft hij meelopen, niet als reserve-na-falen.
Van "geloof de regel" naar "meet het". Een minigene-assay laat de cel het zelf doen — kant-en-klaar bestelbaar, zodat de vraag aan een lab krimpt tot "kloneer dit en doe een RT-PCR".
Het construct — een genomisch stukje exon 22 → exon 24 in een splice-reporter. Twee versies die op precies één base verschillen:
…TCAAAT|GTAGGT… vs. mutant …TCAAAT|GTAGA T…Intron 23 blijft volledig behouden (daar zit het effect); intron 22 is in het midden ingekort, een naad die door Pangolin als splice-neutraal is bevestigd (max Δ 0,09, ver onder de 0,5-drempel). Totaal 5.084 nt, GC 37,4% — synthetiseerbaar als één clonal gene bij Twist / GenScript / IDT.
De uitlezing — RT-PCR met een primer in exon 22 en een in exon 24. Het skip-product is exact 130 bp korter. Op gel zie je het meteen:
WT-construct → overwegend de 299 bp inclusie-band (exon 22-23-24).
Mutant-construct → overwegend de 169 bp skip-band (exon 22-24).
Densitometrie geeft de skip-fractie per allel; Sanger op elke band bevestigt de junctie.
Overwegend 130-nt-skip + Sanger-bevestigde exon22|24-junctie → skip bevestigd; met de NMD-voorspelling hierboven → haploïnsufficiëntie waarschijnlijk → Route 1 verdedigbaar als eerste keuze.
Lage skip-fractie of substantieel afwijkend/getrunceerd product → mechanisme complexer, dominant-negatief niet uitgesloten → Route 2 (base editing) krijgt gewicht.
Locus (GRCh38, + streng): exon 22 75.880.043–75.880.120 · exon 23 75.881.689–75.881.818 · exon 24 75.886.004–75.886.094. Variant c.2416+5G>A = chr6:75.881.823, heterozygoot. Primers: FWD GCTTTGTTTAAAGCTTTGGGCT (exon 22), REV CGAGGTTTGTGTCTCCTCTTGC (exon 24).
Onafhankelijk nagetrokken tegen de bron (Oka et al. 2020, PMC7140843).
Voor c.2416+5G>A is nog nooit een functionele splice-assay gedaan. Oka et al. 2020 — de paper die de variant beschrijft — deed geen enkele RT-PCR of minigene op splice-varianten; hun "in vitro"-werk was een microvilli-elongatie-assay op uitsluitend missense-varianten. Deze variant kreeg "Likely Pathogenic" op basis van in-silico predictie + segregatie alleen (CADD 23.2).
De minigene meet laag 1. Laag 2 en 3 vragen patiëntmateriaal.