MYO6-dossier — variant & gentherapie-ontwerp
De technische kern: wat is c.2416+5G>A precies, en hoe zou een therapie eruit kunnen zien?
ACMG-classificatie
De variant ligt in dezelfde splice-donor-consensus als c.2416+1G>A en c.2416+2T>C, beide Likely Pathogenic in ClinVar. SAI-10k voorspelt expliciet exon 23 skipping → frameshift → premature stopcodon → nonsense-mediated decay. Toegepaste criteria: PVS1 (gereduceerd, predictie-gebaseerd) + PM2_Supporting + PP3_Supporting + PS4_Supporting (Oka et al. 2020 rapporteerde dezelfde variant onafhankelijk in een Japans DFNA22-cohort, familie JHLB3986, eveneens als Likely Pathogenic — twee onafhankelijke probands), met PM1 mogelijk als Moderate gezien de directe nabijheid van twee LP-buren. Dat tilt de variant van VUS naar de grens van Likely Pathogenic. RNA-bevestiging van het skipping-mechanisme zou PVS1 naar Strong tillen en de classificatie definitief op LP/Pathogenic zetten.
In-silico convergentie — vijf onafhankelijke model-families
De ondersteuning voor PP3 komt uit methodologisch onafhankelijke methodes die alle dezelfde kant op wijzen — geen napratende variaties van hetzelfde model:
- SpliceAI (CNN, splice-specifiek): Donor Loss 0,89 op −5 bp
- Pangolin (CNN met tissue-specifieke splice-grammatica): Splice Loss 0,79 op −5 bp
- SAI-10k (SpliceAI-afgeleide met expliciete consequentie-annotatie): voorspelt exon-23-skipping → frameshift
- Carbon-3B (3B-parameter DNA-foundation-model, getraind op 1T tokens, geen splice-labels): score +6,76 nats in een 24 kb context — variant is bovendien #1 op de Carbon-constraint over alle 164 MYO6-SNVs (geen verborgen alternatief in het gen)
- AlphaGenome (DeepMind, multi-modal genomic foundation model): alle vier splice-scorers (SPLICE_SITES, SPLICE_SITE_USAGE, SPLICE_JUNCTIONS, RNA_SEQ) concordant in pathogene richting
Dedicated splice-modellen plus genoom-foundation-modellen die dezelfde conclusie trekken — dat is een sterkere PP3-onderbouwing dan losse SpliceAI-scores. Maar convergentie tussen modellen is geen bewijs: ze voorspellen allemaal hetzelfde soort ding, en een zesde model dat instemt voegt niets toe wat een RNA-meting wél zou geven. De in-silico-stack is zo robuust mogelijk gemaakt; vanaf hier is alleen de functionele assay nog informatief (PVS1 Moderate → Strong).
De mechanisme-gate — nu doorgerekend, nog niet gemeten
Alles in het therapie-ontwerp hangt op één ja/nee-vraag: maakt het kapotte allel niets (haploinsufficiëntie → een werkende kopie bijgeven volstaat) of een getrunceerd, mogelijk dominant-negatief eiwit (→ de bron moet gecorrigeerd)? Tot juli stond in mijn eigen dossier de keten "skip → frameshift → NMD → haploinsufficiëntie" als bewering. Op 4 juli is de laatste stap deterministisch uitgerekend op het MANE-transcript (ENST00000369977), met de sequentie live opgehaald in plaats van uit het geheugen:
- Exon 23 is 130 nt — niet deelbaar door 3, dus een skip verschuift het leesraam (frameshift).
- Voortijdig stopcodon op codon 763, met 11 exon-exon-juncties stroomafwaarts en 1239 nt tot de laatste junctie. De canonieke NMD-grens ligt op ~50–55 nt: dit ligt er mijlenver overheen → sterk NMD-substraat.
- Methode-validatie: hetzelfde script zet het gezonde transcript correct aan de ontsnap-kant (+198 nt, ná de laatste junctie). Alleen het mutante allel triggert de regel — de berekening is dus geen cirkelredenering.
Netto: het mutante allel levert waarschijnlijk ~0 eiwit, wat Route 1 (gene augmentation) verdedigbaar maakt. Structureel sluit dat aan: exon 23 codeert de converter/lever-arm, en een getrunceerd myosine VI is functioneel-null.
De veldaanname, en waarom die mijn gate niet sluit (juli 2026)
Wie navraag doet bij specialisten krijgt een heldere standaardpositie terug: MYO6-gerelateerd gehoorverlies wordt veroorzaakt door haploinsufficiëntie — verlies van functie van één allel volstaat. Dat is de aanname waarop preklinische MYO6-programma's worden gebouwd, en het is belangrijk om te weten, want het bepaalt op welk product ik straks wel of niet zou passen. Maar als antwoord op míjn vraag houdt het geen stand, om twee redenen die naast elkaar staan:
- Het gaat over de klasse, niet over deze variant. Vrijwel alle gepubliceerde dominante MYO6-varianten zijn missense; de klasse-uitspraak is daarop gebouwd. Over een niet-canonieke splice-variant als de mijne luidt het advies in dezelfde adem: test of hij splicing verstoort en tot functieverlies leidt — via een minigene of een RNA-analyse. Dat is geen vaststelling, dat is een verwijzing naar precies de test die nu loopt.
- De Hilgert-tegenwerping wordt er niet door opgelost. Heterozygote dragers van recessieve MYO6-null-allelen (de ouders in DFNB37-families) horen normaal — 50% eiwit is kennelijk genoeg. Als dat klopt, verklaart dosisverlies alléén geen dominante ziekte, en botst "loss-of-function van één allel is voldoende" daar frontaal mee. Ik heb die tegenwerping expliciet voorgelegd; ze werd niet geadresseerd. Dat is geen verwijt — het is een korte mail, geen consult — maar het betekent wel dat de paradox onbeslecht blijft.
Vertrouwen dat de spanning reëel is: hoog. Vertrouwen dat het veld sinds Hilgert (2008) op goede gronden naar haploinsufficiëntie is gekanteld: gemiddeld — plausibel, maar in mijn eigen uitwisselingen niet onderbouwd. Beide kunnen tegelijk waar zijn: de klasse-uitspraak klopt gemiddeld, en mijn variant is een uitzondering. Alleen een meting scheidt die twee.
De vraag die overblijft: de NMD-escape-fractie
Nu er patiënt-RNA komt, verschuift de open vraag van of naar hoeveel. Dat onderscheid is niet academisch — het bepaalt welke therapie kan:
| Uitkomst | Wat er in de haarcel staat | Consequentie voor het ontwerp |
|---|---|---|
| Escape ≈ 0% | Alleen het gezonde allel produceert eiwit; het mutante transcript wordt volledig afgebroken. | Schone haploinsufficiëntie. Gene augmentation volstaat — een extra werkende kopie bijgeven. Ik val binnen de doelgroep van een MYO6-augmentatieproduct. |
| Escape enkele % | Een kleine hoeveelheid afgeknot myosine VI, met intact motor-domein en actine-binding maar zonder cargo-koppeling. | Dominant-negatief effect wordt aannemelijk. Een extra kopie bijgeven naast een storende motor helpt mogelijk onvoldoende — base-editing of allel-silencing wordt relevanter. |
| Geen skipping | De donor wordt ondanks vijf modellen gewoon gebruikt. | De variant is niet de verklaring. Terug naar de WGS — en de vijf-model-consensus was dan een dure les over convergentie. |
Het probleem: een diagnostische RT-PCR meet dit niet. Die beantwoordt de ACMG-vraag — skip ja of nee — en dat is precies waarvoor de aanvraag is ingediend. De fractie meet je door de gekweekte cellen te splitsen, de ene helft te behandelen met een NMD-remmer (bijvoorbeeld cycloheximide of een gerichte remmer van de opruimroute) en het mutante allel apart te kwantificeren; wat er bij remming méér verschijnt, is wat er normaal wordt weggeruimd. Dat is onderzoekswerk. Als de uitslag straks alleen "skipping bevestigd" zegt, is de klinische vraag beantwoord en de mijne nog niet.
Het minigene-construct — van hoofdroute naar reserve (27 jul 2026)
Om de vraag aan een lab zo klein mogelijk te maken, is de assay uitgewerkt tot op bestelniveau. Niet "zet een studie op", maar "bestel deze twee fragmenten, kloneer ze, draai één RT-PCR":
De uitlezing is binair genoeg om een gate mee te sluiten: blijft exon 23 in het transcript, dan krijg je een band van 299 bp; wordt het overgeslagen, dan 169 bp — precies 130 nt korter. De verhouding tussen beide banden is meteen de skip-fractie die de berekening hierboven níét kan geven. Bij de QC bleek dat de tweede intron-naad (3.585 nt) te groot is voor SpliceAI en Pangolin om splice-neutraal te verifiëren; daarom blijft intron 23 volledig behouden, wat het construct groter maakt maar elke twijfel over een kunstmatig artefact wegneemt.
Onafhankelijk nagetrokken: voor c.2416+5G>A is nog nooit een functionele splice-assay gedaan — Oka et al. 2020 rapporteerden de variant wel, maar testten alleen missense-varianten functioneel. Deze meting zou de eerste ter wereld zijn, en levert het ACMG PS3-bewijs waar de classificatie op wacht. Volledige berekening + constructopbouw →
Gentherapie-ontwerpbrief — wat het is, wat het niet is
Wat het niet is: een buildbare specificatie, of een belofte van een vector op korte termijn. Eerste MYO6-trial is realistisch 2028–2032. Bespoke n-of-1-therapieën bestaan (Milasen-precedent), maar kosten miljoenen en gaan vrijwel altijd over fatale kinderziekten.
Wat het wél is: een target product profile dat alle ontwerp-parameters voor c.2416+5G>A op één plek zet, met expliciete aannames en open vragen. Drie doelen: (1) werkdocument dat meegroeit met nieuwe data, (2) overdraagbaar stuk voor Shu, Kriek, Rutten, (3) pipeline-positionering — als MYO6-trials starten, is deze variant gekarakteriseerd en Onno aangehaakt.
Ontwerp-parameters (mits haploinsufficiëntie bevestigd)
- Strategie: gene augmentation (AAV gene addition) — geen silencing nodig. Otarmeni-blauwdruk.
- Payload: MYO6 CDS ~3855 bp; AAV-capaciteit ~4,7 kb incl. ITRs/promoter/polyA — zeer krap. Single-AAV met minimale promoter, of dual-AAV (lagere efficiëntie).
- Promoter: hair-cell-specifiek (vergelijkbaar met Myo15-promoter in Otarmeni). Moet compact.
- Toediening: intracochleaire AAV-infusie via ronde venster — sinds Otarmeni bewezen veilig.
- Patiënt-specifiek: adult-onset (geen publieke MYO6-data voor volwassenen); ski-slope (hoge frequenties vermoedelijk reeds verloren); lage frequenties hebben restgehoor → het targetweefsel.
Tweede route (juni 2026): base-editing — mechanisme-agnostisch
Sinds de KCNQ4/DFNA2-doorbraak (adenine base editor, EMBO Mol Med, mei 2026) ligt er een tweede route naast augmentation. c.2416+5G>A is een G→A; een ABE zet exact die letter terug (A→G) en herstelt de splice-donor. Eigen analyse (29 juni): standaard-SpCas9 valt af, maar een PAM-flexibele SpRY-ABE8e heeft een schoon venster (plaatsing p=4, geen bystander-A), en de editor-landingsplaats is leesbewezen intact op het eigen allel (~40x dekking, 0 alt-reads op de PAM). Voordeel: variant-correctie hangt niet op de mechanisme-gate — het werkt ongeacht haploinsufficiëntie vs dominant-negatief. Caveats: SpRY heeft meer off-target, levering vraagt dual-AAV, en splice-herstel na correctie moet functioneel bewezen worden.